以下为建议参考方法，如需进一步优化实验条件，建议根据具体实验进行测试验证。
浓度配比方法
1. 母液配制（储存液）
推荐浓度：
15 mg/mL（约30 mM），溶解于无菌PBS（pH 7.4）或 超纯水中。
示例：
称取 15 mg D-荧光素钾盐 → 溶解于 1 mL 溶剂 → 涡旋震荡至完全溶解 → 0.22 μm滤膜过滤除菌 → 分装避光保存（-20℃）。
2. 工作液配制
体外实验（酶标仪、细胞裂解液检测）：
终浓度：150 μg/mL（约0.3 mM）
稀释方法：取母液（15 mg/mL）按 1:100 稀释（例如：1 μL母液 + 99 μL PBS）。
活体成像（小动物实验）：
注射浓度：15 mg/mL（直接使用母液或稀释至所需体积）
注射剂量：
小鼠：150 mg/kg 体重（如20 g小鼠注射3 mg，溶于200 μL PBS）。
大鼠：100-150 mg/kg 体重，根据模型优化。
关键操作步骤
溶解：
若溶解困难，可轻微涡旋或37℃短暂温育（≤5分钟），避免高温导致降解。
禁用溶剂：含钙/镁的缓冲液（如DMEM）、强酸性溶液（pH <6.0）。
过滤除菌：
必须使用 0.22 μm无菌滤膜 过滤，避免微生物污染（尤其体内实验）。
分装保存：
分装为单次用量（如100 μL/管），-20℃避光保存，避免反复冻融（最多冻融3次）。
注意事项
1. 稳定性与保存
固体粉末：-20℃干燥避光保存，避免吸湿。
液体母液：-20℃保存 ≤6个月；4℃保存 ≤1周（避光）。
2. 体内实验关键点
无菌性：注射前需确保溶液无菌（过滤或购买无菌成品）。
注射时间：腹腔注射后 10-15分钟 达到信号峰值；静脉注射后 2-5分钟成像。
背景控制：实验前禁食（减少肠胃自发荧光），擦拭动物眼部分泌物。
3. 常见问题处理
沉淀产生：若溶液浑浊，检查溶剂pH（需7.0-7.4）或缓冲液成分（避免Ca²⁺/Mg²⁺）。
信号弱：
可能原因：荧光素酶表达量低、底物浓度不足、成像时间过早/过晚。
解决方案：提高底物浓度至 300 μg/mL 或延长成像时间（需预实验优化）。 |
中文
英文