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2X M5 HiPer SYBR Premix EsTaq (with Tli RNaseH) |
产品介绍: |
2X M5 HiPer SYBR Premix EsTaq (with Tli RNaseH) 使用说明书
产品名称 |
单位 |
货号 |
2X M5 HiPer SYBR Premix EsTaq (with Tli RNaseH) |
50 μl 反应 × 40 次 |
TOP787-T |
2X M5 HiPer SYBR Premix EsTaq (with Tli RNaseH) |
50 μl 反应 × 200 次 |
TOP787-01 |
2X M5 HiPer SYBR Premix EsTaq (with Tli RNaseH) |
50 μl 反应 × 400 次 |
TOP787-02 |
【储存条件】长期保存,请置于-20˚C,有效期 24 个月。经常使用,可置于 4˚C 保存至少六个月。 【产品简介】本产品采用 Sybrgreen 嵌合荧光法进行荧光定量的专用试剂。制品中含有荧光定量反应的最适浓度 Sybrgreen,是一种 2×浓度的预混试剂,进行实验时,PCR 反应液的配制十分方便简单。制品中使用了 antiTaq 抗体的 Hot Start 法用 DNA 聚合酶,与荧光定量反应适合 Buffer 组合,可以有效抑制非特异性的 PCR 扩增,大大提高 PCR 的扩增效率,可以进行高灵敏度的荧光定量扩增反应。另外,本产品中添加了 Tli RNaseH (耐热性 RNaseH),以 cDNA 作为模板进行 PCR 反应时,可以很好地抑制由于 cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用。 适合于快速荧光定量扩增反应,可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对靶基因进行准确定量、检测,重复性好,可信度高。 【产品组份】 TOP787-T TOP787-01 2x M5 HiPer SYBR Premix EsTaq (withTli RNaseH) * 1.0 ml 5x1ml ROX Reference Dye(50×)** 40μl 200μl ROX Reference Dye II(50×)** 40μl 200μl *由以下组分预混而成:EsTaq,dNTP Mixture,Mg2+,Tli RNaseH,Sybrgreen。 ** ROX Reference Dye 是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。例如使用 Applied Biosystems 的 Real Time PCR 扩增仪进行实验就需要校正。 ◆ 需要使用 ROX Reference Dye 校正的仪器 Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific) ◆ 需要使用 ROX Reference Dye II 校正的仪器 Applied Biosystems 7500 和 7500 Fast Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific) ◆ 不需要校正的仪器 Thermal Cycler Dice™ Real Time System III .Thermal Cycler Dice Real Time System Lite 。 Smart Cycler II System(Cepheid) LightCycler/LightCycler 480 System (Roche Diagnostics) CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) 【使用注意】 1.使用前,请上下轻轻颠倒混匀,避免产生气泡,防止因混合不均匀造成的反应效果不佳。但请勿涡旋振荡混匀。 2.Sybrgreen Premix EsTaq 在-20℃存放可能会产生白色或淡黄色的沉淀,可用手握缓慢溶解,于室温短时间避光放置,轻柔上下颠倒混匀直至沉淀全部消失。沉淀会导致溶液成分不均匀,使用前务必充分混匀试剂。 3.配制反应液时,试剂请于冰上放置。反应液的配制、分装请一定使用新的(无污染的)枪头、Microtube 等,尽量避免污染。 4. 本制品中含有荧光染料 Sybrgreen,配制 PCR 反应液时应避免强光照射。
【所需试剂】 本产品为 2×预混荧光定量 PCR 反应体系,使用时只需加入模板、引物和水,使其工作浓度为 1×,即可进行反应。具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点,可最大限度地减少人为误差、节约 PCR 实验操作时间、降低污染几率。
【操作示例】 注意:请严格按照不同仪器的操作手册进行实验。 一、 以 Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System 和 StepOnePlus Real-Time PCR System 的操作方法为例 1、按下表配制 PCR 反应体系:
组分名称 |
50ul 体系 |
20ul 体系 |
Template DNA*** |
4 µl |
2µl |
2x M5 HiPer SYBR Premix EsTaq (withTli RNaseH) |
25 μl |
10µl |
Primer 1 (10μM)* |
1 µl |
0.4µl |
Primer 2 (10μM)* |
1 µl |
0.4µl |
ROX Reference Dye (50x) or ROX Reference Dye II (50x)** |
1 µl |
0.4µl |
ddH2O |
18 µl |
6.8µl |
|
50 µl |
20ul |
*通常引物终浓度为 0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时,可以在 0.1~1.0 μM 范围内调整引物浓度。 **ROX Reference Dye II(50x)比 ROX Reference Dye(50x)浓度低,使用 7500 /7500 Fast Real-Time PCR System 时,请使用 ROX Reference Dye II(50x)。 使用 ABI PRISM 7300 Real-Time PCR System 和 StepOnePlus 时,请使用 ROX Reference Dye(50×)。 *** 20 μl 反应体系中,DNA 模板的添加量要在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时需要进行梯度稀释,以确定合适的 DNA 模板添加量。 如果欲使用本产品进行 Two-Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩增反应,第一步的 RT 反应液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。 2、进行 荧光定量 PCR 反应 < Applied Biosystems 7300/7500 和 StepOnePlus Real-Time PCR System > 两步法 PCR 扩增标准程序: Stage 1:预变性 循环数:1 95℃ 30 秒 Stage 2:PCR 反应 循环数:40 95℃ 5 秒 60℃ 30~34 秒 * Dissociation stage * 使用 StepOnePlus 时请设定 在 30 秒。 使用 7300 时请设定在 31 秒。 使用 7500 时请设定在 34 秒。 两步法 PCR 扩增标准程序: Stage 1: 预变性 循环数: 1 95℃ 30 秒 Stage 2: PCR 反应 循环数: 40 95℃ 3 秒 60℃ 30 秒 Stage 3: Melt Curve 注意: 1) 本产品是利用 anti-Taq 抗体的 Hot Start 用 DNA 聚合酶,与其他公司的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比,不需要 PCR 反应前的 95℃、5~15 分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长,会使酶的活性下降,其 PCR 的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。 如果在 PCR 反应前进行模板的预变性,通常设定为 95℃、30 秒。 2) 如果以上两步法程序得不到良好的实验结果时,请再进行 PCR 条件的优化。由于使用 Tm 值较低的引物等原因,两步法 PCR 反应扩增性能较差时,可以尝试进行三步法 PCR 扩增反应。 3、标准曲线制作和结果分析反应结束后确认荧光定量 PCR 的扩增曲线和融解曲线,进行 PCR 定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。 二、 以 LightCycler/LightCycler480 System 的操作方法为例 1、按下表配制 PCR 反应体系:
组分名称 |
20ul 体系 |
Template DNA** |
2µl |
2x M5 HiPer SYBR Premix EsTaq (withTli RNaseH) |
10µl |
Primer 1 (10μM)* |
0.4µl |
Primer 2 (10μM)* |
0.4µl |
ddH2O |
7.2µl |
|
20ul |
*通常引物终浓度为 0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时,可以在 0.1~1.0 μM 范围内调整引物浓度。 ** 20 μl 反应体系中,DNA 模板的添加量要在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时需要进行梯度稀释,以确定合适的 DNA 模板添加量。如果欲使用本产品进行 Two-Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩增反应,第一步的 RT 反应液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。 2、进行 荧光定量 PCR 反应 PCR 反应用毛细管请用离心机轻轻离心后放入 LightCycler 中进行荧光定量 PCR 反应。建议采用下列显示的两步法 PCR 反应程序,如果该程序得不到良好的实验结果时,再进行 PCR 条件的优化。 由于使用 Tm 值较低的引物等原因,两步法 PCR 反应扩增性能较差时,可以尝试进行三步法 PCR 扩 增反应。 < LightCycler> 两步法 PCR 扩增标准程序: Stage 1:预变性 循环数:1 95℃ 30 秒 20℃/秒 Stage 2:PCR 反应 循环数:40 95℃ 5 秒 20℃/秒 60℃ 20 秒 20℃/秒 Stage 3:融解曲线分析 95℃ 0 秒 20℃/秒 65℃ 15 秒 20℃/秒 95℃ 0 秒 0.1℃/秒 < LightCycler 480 System>两步法 PCR 扩增标准程序: 变性 95℃ 30 秒(Ramp rate:4.4℃/秒) 1 cycle PCR 分析模式:定量分析 95℃ 5 秒 (Ramp rate:4.4℃/秒) 60℃ 30 秒. (Ramp rate:2.2℃/秒,Acquisition Mode : Single) 40 cycles 融解 分析模式:融解曲线 95℃ 5 秒 (Ramp rate:4.4℃/秒) 60℃ 1 分钟 (Ramp rate:2.2℃/秒) 95℃ (Ramp rate:0.11℃/秒, Acquisition Mode : Continuous, Acquisitions : 5 per℃) 1 cycle 降温 50℃ 30 秒 (Ramp rate:2.2℃/秒) 1 cycle 注意:本产品是利用 anti-Taq 抗体的 Hot Start 用 DNA 聚合酶,与其他公司的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比,不需要 PCR 反应前的 95℃、5~15 分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长,会使酶的活性下降,其 PCR 的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。 如果在 PCR 反应前进行模板的预变性,通常设定为 95℃、30 秒。 3、标准曲线制作和结果分析 反应结束后确认荧光定量 PCR 的扩增曲线和融解曲线,进行 PCR 定量时制作标准曲线等。 分析方法参见仪器的操作手册。 1、按下表配制 PCR 反应体系:
组分名称 |
25ul 体系 |
Template DNA** |
2µl |
2x M5 HiPer SYBR Premix EsTaq (withTli RNaseH) |
12.5µl |
Primer 1 (10μM)* |
0.5µl |
Primer 2 (10μM)* |
0.5µl |
ddH2O |
9.5µl |
|
25ul |
*通常引物终浓度为 0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时,可以在 0.1~1.0 μM 范围内调整引物浓度。 ** 20 μl 反应体系中,DNA 模板的添加量要在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时需要进行梯度稀释,以确定合适的 DNA 模板添加量。如果欲使用本产品进行 Two-Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩增反应,第一步的 RT 反应液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。 2、进行 荧光定量 PCR 反应 PCR 反应管请用离心机轻轻离心后放入 Smart Cycler 中进行荧光定量 PCR 反应。建议采用下列显示的两步法 PCR 反应程序,如果该程序得不到良好的实验结果时,再进行 PCR 条件的优化。 由于使用 Tm 值较低的引物等原因,两步法 PCR 反应扩增性能较差时,可以尝试进行三步法 PCR 扩 增反应。 两步法 PCR 扩增标准程序: Stage 1:预变性 Hold 95℃ 30 秒 Stage 2:PCR 反应循环数:40 95℃ 5 秒 60℃ 20 秒 Stage 3:Melt Curve 注意:本产品是利用 anti-Taq 抗体的 Hot Start 用 DNA 聚合酶,与其他公司的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比,不需要 PCR 反应前的 95℃、5~15 分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长,会使酶的活性下降,其 PCR 的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。 如果在 PCR 反应前进行模板的预变性,通常设定为 95℃、30 秒。 3、标准曲线制作和结果分析反应 结束后确认荧光定量 PCR 的扩增曲线和融解曲线,进行 PCR 定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。
四、 以 CFX96 Real-Time PCR Detection System 的操作方法为例 1、按下表配制 PCR 反应体系:
组分名称 |
25ul 体系 |
Template DNA** |
2µl |
2x M5 HiPer SYBR Premix EsTaq (withTli RNaseH) |
12.5µl |
Primer 1 (10μM)* |
0.5µl |
Primer 2 (10μM)* |
0.5µl |
ddH2O |
9.5µl |
|
25ul |
*通常引物终浓度为 0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时,可以在 0.1~1.0 μM 范围内调整引物浓度。 ** 20 μl 反应体系中,DNA 模板的添加量要在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时需要进行梯度稀释,以确定合适的 DNA 模板添加量。如果欲使用本产品进行 Two-Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩增反应,第一步的 RT 反应液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。 2、进行 荧光定量 PCR 反应 建议采用下列显示的两步法 PCR 反应程序,如果该程序得不到良好的实验结果时,再进行 PCR 条件的优化。 由于使用 Tm 值较低的引物等原因,两步法 PCR 反应扩增性能较差时,可以尝试进行三步法 PCR 扩 增反应。 两步法 PCR 扩增标准程序: 样品体积:25 μl Step 1:95℃ 30 秒 Step 2:PCR 反应 GOTO:39(40 Cycles) 95℃ 5 秒 60℃ 30 秒 Step 3:Melt Curve 注意:本产品是利用 anti-Taq 抗体的 Hot Start 用 DNA 聚合酶,与其他公司的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比,不需要 PCR 反应前的 95℃、5~15 分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长,会使酶的活性下降,其 PCR 的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。 如果在 PCR 反应前进行模板的预变性,通常设定为 95℃、30 秒。 3、标准曲线制作和结果分析反应结束后确认荧光定量 PCR 的扩增曲线和融解曲线,进行 PCR 定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。
五、 以 Thermal Cycler Dice Real Time System III and Lite 的操作方法为例 1、按下表配制 PCR 反应体系:
组分名称 |
25ul 体系 |
Template DNA** |
2µl |
2x M5 HiPer SYBR Premix EsTaq (withTli RNaseH) |
12.5µl |
Primer 1 (10μM)* |
0.5µl |
Primer 2 (10μM)* |
0.5µl |
ddH2O |
9.5µl |
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25ul |
*通常引物终浓度为 0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时,可以在 0.1~1.0 μM 范围内调整引物浓度。 ** 20 μl 反应体系中,DNA 模板的添加量要在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时需要进行梯度稀释,以确定合适的 DNA 模板添加量。如果欲使用本产品进行 Two-Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩增反应,第一步的 RT 反应液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。 2、进行 荧光定量 PCR 反应 建议采用下列显示的两步法 PCR 反应程序,如果该程序得不到良好的实验结果时,再进行 PCR 条件的优化。 由于使用 Tm 值较低的引物等原因,两步法 PCR 反应扩增性能较差时,可以尝试进行三步法 PCR 扩 增反应。 两步法 PCR 扩增标准程序: Stage 1:预变性 Repeat:1 95℃ 30 秒 Stage 2:PCR 反应 Repeat:40 95℃ 5 秒 60℃ 30 秒 Stage 3:Dissociation 注意:本产品是利用 anti-Taq 抗体的 Hot Start 用 DNA 聚合酶,与其他公司的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比,不需要 PCR 反应前的 95℃、5~15 分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长,会使酶的活性下降,其 PCR 的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。 如果在 PCR 反应前进行模板的预变性,通常设定为 95℃、30 秒。 3、标准曲线制作和结果分析 反应结束后确认荧光定量 PCR 的扩增曲线和融解曲线,进行 PCR 定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。 【实验条件优化】 如果按照推荐的两步法条件进行反应,反应性能不好时,请按照下面的方法进行引物和 PCR 反应条件的优化。另外,根据反应情况选择特异性不同的 qPCRmix, 可提高 PCR 反应性能。 实验条件选择时,请从反应特异性与扩增效率两方面进行综合考虑。要求能同时满足这两个条件的反应体系,才可以在较大浓度范围内进行很好的定量。 A、反应特异性高的实验体系应具备以下条件: No Template Control 时不产生引物二聚体等非特异性扩增。不产生目的片段以外的扩增。 B、扩增效率高的实验体系应具备以下条件:扩增产物起峰更早(Ct 值小)。 PCR 扩增效率高(接近理论值 100%)。 C、降低 Primer 浓度有助于提高特异性;提高 Primer 浓度有助于提高扩增效率。 D、要提高反应特异性,可以提高退火温度。要提高扩增效率,可以增加延伸时间或变为 3 Step PCR 反应。 E、预变性条件通常设定为 95℃ 30 秒,使用此条件对于难变性的环状质粒 DNA 和基因组 DNA 模板 基本上也能够很好的变性。如果对难变性的模板想改变变性条件,可以延长至 1~2 分钟。但是时 间过长酶容易失活,不推荐使用 2 分钟以上的变性条件。 【引物设计】 进行荧光定量 PCR 反应时,设计反应性能良好的 PCR 引物非常重要。根据以下原则,可以设计 PCR 扩增效率高,反应特异性强的良好引物。 PCR 扩增产物长度: 80~150 bp 较为合适(可以延长至 300 bp)。 设计引物要求如下: A、引物长度: 17~25 mers B、GC 含量: 40~60%(45~55%理想) C、Tm 值:Forward Primer 和 Reverse Primer 的 Tm 值不能相差太大。 Tm 值的计算使用专用软件。 OLIGO: 63~68℃ Primer3:60~65℃ D、引物序列:A、G、C、T 整体分布尽量均匀。不要有部分的 GC rich 或 AT rich(特别是 3’端)。避开 T/C(Polypyrimidine)或 A/G(Polypurine)的连续结构。 E、3’末端序列:避免 GC rich 或 AT rich。 3’端碱基最好为 G 或 C。尽量避免 3’末端碱基为 T。 E、互补序列:避开引物内部或两条引物之间有 3 个碱基以上的互补序列。两条引物间的 3’末端避开有 2 个碱基以上的互补序列。特异性 使用 BlAST *3 检索确认引物的特异性。 * |
备注:
以上数据均来自公开文献,博奥拓达暂未进行独立验证,仅供参考。
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